在高通量数字化芯片的加工与改性方面，周连群课题组的李金泽、邱亚军等人在Analyst上发表题为Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction的论文，提出了针对数字化芯片三维异质性改性的新策略，通过内壁亲水、表面疏水的异质性化学改性，实现了高填孔率、低残留的数字化样品分割。通过深硅刻蚀可以得到高密度蜂窝状微孔阵列，如何保证待测生物样本能高效的填充入微孔，并且降低液体在表面残留导致的孔间连通，是数字化样品分割的关键。针对该问题科研人员提出了对于均质硅材料的三维异质性改性策略，即通过微接触印刷只在特定的空间位置发生化学修饰，进而在均质材料的三维空间上形成具有不同化学性质的界面。通过工艺优化消除了样本挥发导致的扩散效应，实现了芯片表面的选择性疏水修饰。三维异质性改性后的芯片可以达到91%以上的填孔率以及小于5%的液体残留率，优于商业化的数字PCR芯片。利用该芯片可以实现高效准确的dPCR检测，定量结果的线性相关性达到0.999以上。该核心技术的突破为自研cdPCR的精准定量奠定了坚实基础。
图1 高通量数字化核酸检测芯片的三维异质性改性效果图
在样本的数字化分配与封装方面，周连群课题组的高旭等人在Biomicrofluidics上发表题为High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels的论文，提出了针对数字化芯片的微流控进样封装方法，通过双S型流道夹心数字化芯片的结构，有效提高的样品的填孔率和装载重复性。传统的刷样方式，受限于操作的繁琐性，存在耗时长、重复性差、易污染的问题，限制了芯片式数字PCR的应用。通过微流控结合标准化仪器设备，可以实现进样封装的标准化和自动化，简化用户的手动操作步骤和整体样品装载和封装时间。本文主要通过流体力学仿真结合试验验证，解决了流体样本与微孔相互作用过程中的稳定性、均匀性和重复性问题，通过合理的结构设计和优化的进样条件，实现了填孔率大于99%、填孔液体体积CV达6%的高效、高均匀性进样与封装。该成果的突破有效提升了自研cdPCR的易用性，为产品的临床应用推广奠定了良好基础。
图2 数字化芯片的微流控进样封装结构：(a)结构装配图;(b)结构爆炸图
在芯片式数字化核酸检测的应用方面，周连群课题组与华山医院检验医学科关明课题组合作在Sensors & Actuators: B. Chemical(中科院I区)上联合发表题为Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers的论文，对骨髓增殖性肿瘤(MPN)的多重标志物实现了超敏、多靶标、定量检测，从而为这种罕见病的早期诊断和靶向治疗提供新的方法。Ph染色体(费城染色体)阴性的经典骨髓增殖性肿瘤是以一系或多系分化相对成熟的骨髓造血干细胞持续克隆性增殖为特征的恶性血液疾病。随着分子生物学技术的迅速发展，越来越多的分子标志物被不断发现。根据世界卫生组织(WHO)最新的骨髓增殖性肿瘤诊断标准，JAK2、MPL 和CALR三个基因的突变已被作为骨髓增殖性肿瘤诊断的重要参考指标。周连群研究员课题组与关明教授课题组“医-工”结合，将环介导等温扩增(LAMP)技术快速等温扩增的优势、微流控技术高通量的优势和数字PCR技术准确定量的优势进行整合，成功开发了一款数字LAMP检测平台，并基于纳米粒子的特殊功能，对现有的LAMP检测体系进行了改良，可在60分钟内实现骨髓增殖性肿瘤CALR-1、CALR-2和JAK2 V617F分子标志物的准确定量检测，检测灵敏度分别为0.5%、0.1%和0.5%突变水平。与现有的商业化数字PCR平台相比，本项目开发的数字LAMP平台具有检测成本低、检测速度快等优势，具有良好的应用前景。论文的第一作者为曹国君博士和李金泽博士。
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苏州医工所周连群团队在芯片式数字PCR检测技术和仪器研制方面取得系列进展